金纳米立方体催化邻苯二胺的机理研究

纳米酶（nanozymes）是一类新兴的人工酶，与天然酶相比，纳米酶在高稳定性、低成本和易于规模化生产等方面具有显著优势，在构建生物传感器、免疫测定、纳米医学和环境修复等领域体现出广泛且重要的应用价值。2007 年，我国科学家阎锡蕴及其合作者首次发现并报道了四氧化三铁磁性纳米颗粒(Fe₃O₄ MNPs)具有类过氧化物酶活性 (Nat. Nanotechnol. 2007, 2, 577-583. )，开辟了纳米酶研究的新领域。自此之后，数百种纳米材料，包括金属、金属氧化物、碳材料以及单原子催化剂应运而生，作为过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、水解酶等的酶模拟物，极大地丰富和拓展了纳米酶种类(Chem. Soc. Rev. 2019, 48, 1004-1076)。随着纳米技术的发展，纳米酶研究日新月异，衍生出“纳米酶学”这一活跃的研究领域。

为了深入理解纳米酶的催化机制并合理设计更高效率的、具有特定功能的新型纳米酶，建立标准化的方法来测定纳米酶的催化活性至关重要。评估纳米酶的催化活性方法中，最广泛应用的方法是比色法。常用的比色底物包括 3,3,5,5-四甲基联苯胺 (TMB)、邻苯二胺 (OPD) 和 2,2'-叠氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)等，它们在特定的酶的催化作用下会产生相应的显色反应，从而直观的表征酶活性和酶催化动力学常数（基于典型的Michaelis–Menten 动力学方法）。其中，纳米酶催化邻苯二胺 (OPD)氧化反应已被列为确定纳米酶活性的标准方案，无色的OPD 被氧化成具有特征黄色的氧化产物（通常被认为是二聚体形式，即 2.3-二氨基吩嗪）。然而，OPD 是一种芳香族单体，它的氧化过程复杂，可导致多种不同产物。

尽管OPD氧化反应被广泛用于评估酶的催化活性，其在纳米酶体系中的催化原理仍未有人探究。因此，系统研究纳米酶催化 OPD 氧化过程以及产物类型，对于阐明纳米酶催化OPD 氧化的机制，从而合理地制定评估纳米酶催化活性的标准方法至关重要。在这篇研究报告中，研究者从多个角度对纳米酶催化 OPD 氧化的过程及产物进行研究，发现纳米酶催化过程中OPD会在纳米酶表面形成聚合物层，催化过程存在着与天然酶催化完全不同的机理。

在金纳米立方体（Au NCs）催化OPD氧化过程中，作者发现随着反应进行，Au NCs的紫外-可见光吸收光谱的特征峰位置产生明显的红移（约60 nm），说明Au NCs的表面介电环境或者形貌产生了变化。如图1所示，通过透射电子显微镜表征和元素分析，发现催化OPD氧化反应之后Au NCs表面形貌发生了变化，形成了一层富含氮和碳元素的表面覆盖物层。结合傅立叶变换红外光谱 (FTIR)、核磁共振 (NMR)和电喷雾电离质谱 (ESI-MS) 等分析表征方法，确定了表层覆盖层的主要成分为聚邻苯二胺（POPD）。作者设计了对比实验，证明与裸露的Au NCs相比，POPD层包覆的Au NCs能够有效地防止被蚀刻，这说明聚合物层会阻碍外部离子渗透，这引发了思考：表层被覆盖的纳米酶Au NCs与比色底物的直接接触被阻隔，是否会直接影响纳米酶的催化活性？

图1 (a,b) 催化反应前后Au NCs的形貌图：a）催化前，b）催化后；(c,d) Au NCs催化 OPD 氧化过程中的紫外-可见光谱变化；(e, f) 表面包覆层成分的傅立叶红外/核磁光谱表征。

基于芳香族单体通常遵循的自由基阳离子氧化聚合机理，纳米酶催化反应的机理如图2所示。整个催化过程分两个阶段进行：初始阶段，过氧化氢吸附在Au NCs表面，O-O键断裂产生活性氧羟基自由基（HO•）。随后HO• 攻击 OPD 单体产生自由基阳离子，通过静电作用附着在Au NCs的表面，相互偶联形成低聚物。在第二阶段，包覆在Au NCs上的 POPD 通过自催化作用促进 OPD 的进一步氧化，形成更多的自由基阳离子连接到末端实现链增长，从而导致 POPD层的增厚。此外，导电聚合物的强 π-π 堆积作用以及氢键协同效应也促进了 POPD 在Au NCs表面组装形成更大尺度范围的聚集体。

图2 纳米酶催化 OPD 氧化过程机理的示意图（形成表面包覆层）

为了进一步探究表面包覆对纳米酶催化活性的影响，通过调整底物H₂O₂ 和TMB 的浓度，测定紫外-可见光吸收光谱，得到Michiaelis-Menten 曲线以评估纳米酶催化的稳态动力学过程。经计算发现，包覆前后的Au NCs酶特异性参数（米氏常数K_m和催化常数K_cat）产生了明显差异，表面包覆POPD的Au NCs具有更高的底物的亲和力和类过氧化物酶催化活性（图3a-b）。此外还发现，表面包覆POPD层的Au NCs在中性条件下产生了独有的类氧化酶活性，能够在不加入H₂O₂的情况下促进 TMB 被氧化变色，这是不同于普通的Au NCs的。如图3c-e 所示。因此，作者推断，发生在Au NCs表面的意外聚合形成致密的聚合物层，不仅阻断了纳米酶的活性位点，而且还改变了初始纳米酶的催化活性。

图3 表面包覆后的Au NCs纳米酶催化活性变化

为了验证纳米酶上发生 OPD 聚合的普遍性，作者用一些其它常见的过氧化物纳米酶替换Au NCs来实验。在以OPD为底物的比色反应中，四氧化三铁（Fe₃O₄）、钯（Pd）、铂（Pt）、二氧化铈（CeO₂）、普鲁士蓝（PB）等多种纳米酶的表面同样观察到被聚合物层紧密覆盖(图4)。更重要的是，证实了POPD 包覆层会改变Fe₃O₄纳米酶的表面性质和催化活性，结果与Au NCs中的发现相一致（图5）。上述实验结果进一步明确了在纳米酶催化反应的过程当中，底物OPD在纳米酶表面发生聚合并形成包覆层这一现象是具有普适性的。

图4 Pd、Pt、CeO₂ 、PB等多种纳米酶的表面包覆现象

图5 表面包覆POPD后Fe₃O₄催化活性改变(a,c对应包覆前，b,d对应包覆后)

为了系统地阐释纳米酶催化OPD氧化的反应机理，作者从多个角度入手进行了详尽的分析，得出结论——纳米酶的表面发生了OPD 的氧化聚合，使得纳米酶的固有特性发生了显著的变化。经过多种纳米酶的验证，该现象具有普适性。本研究首次发现在纳米酶催化OPD氧化过程中，在纳米酶表面发生OPD的氧化聚合并形成聚合物的致密涂层，改变了纳米酶的固有特性。在这种情况下，基于 OPD 的比色法对纳米酶活性的动力学研究不能反映纳米酶的固有活性，在使用时应当格外注意纳米酶的表面变化。同时，首次发现 POPD 是一种新型类氧化酶，丰富和发展了纳米酶的种类和数量。总之，本篇研究结果突出了在催化反应中监测纳米酶表面变化的重要性，在多相催化过程中结合适当表征技术可能有益于纳米酶催化机理的研究以及其真正催化活性位点的鉴定。

参考文献

Lu Cheng, Fengxia Wu, Haibo Bao, Fenghua Li, Guobao Xu, Yongjun Zhang,* and Wenxin Niu*

Unveiling the Actual Catalytic Sites in Nanozyme-Catalyzed Oxidation of o-Phenylenediamine

Small 2021, 2104083