酶触发金纳米星上的晶体生长用于等离子体和光热免疫分析

研究背景

  高度敏感且简单的疾病生物标志物检测是癌症早期诊断、治疗和有效管理的一个重要挑战。在已报道的方法中，酶联免疫吸附法(ELISA)已被广泛用于微量生物标志物的检测。ELISA法结合了抗原-抗体识别和酶的生物催化特性，如碱性磷酸酶(ALP)，其优良的催化活性被广泛应用。ELISA的一个主要优点是，单个酶分子可以催化将许多底物分子转化为产品，为分析物的敏感检测产生可测量的信号。然而，目前的ELISA检测技术如表面增强拉曼散射、荧光、电化学、和电化学发光等，往往需要先进的仪器和专业的操作据我们所知，在没有先进设备的情况下，传统的免疫分析方法主要是通过肉眼进行基于金纳米粒子的比色法，但通过颜色变化进行筛选的灵敏度很低。因此，开发简单、灵敏、可直接读出的免疫传感器对于即时检测和临床诊断尤为迫切。近年来，具有可调谐局部表面等离子体共振(LSPR)峰的金纳米星(AuNS)在生物传感和生物医学领域显示出巨大的应用潜力。例如,在葡萄糖氧化酶介导的晶体生长过程中，由于LSPR可由晶体的形态、大小、颗粒组成和局部介电环境的折射率等因素控制，因此AuNS已被用于生物分析。值得注意的是，当等离子体带位于近红外光学窗口时，AuNS可以有效地吸收光并将其转化为热，而热可以转移到周围环境中，导致温度升高同时，机理研究表明，金属纳米晶体的光热转换效率受等离子体共振波长、壳层和组装等因素的控制，这是通过纳米晶体的等离子体共振能量的变化来实现。与有机光热剂相比，无机纳米材料具有良好的光热稳定性和化学稳定性据报道，近红外吸收截面金纳米结构比传统的有机染料多出几个数量级，且尖刺金纳米结构可以显著增强光-热转换。此外，由光热效应引起的温度信号，无需使用先进的分析仪器，用温度计就可以很容易地以高灵敏度检测到。基于这些事实，我们开发了一种等离子体光热纳米传感器，该传感器可通过酶触发在AuNS上晶体生长，通过颜色和温度实现双读出免疫分析。两种分析方法的结合可望得到更可靠、更精确的结果。本研究选择前列腺特异性抗原(PSA)作为ELISA检测的模型分析物，因为PSA是前列腺癌早期诊断的重要生物标志物，PSA检测是临床诊断的关键。我们首先研究了ALP触发的纳米传感器的LSPR位移和光热转换在镀银的AuNS上的晶体生长。由于LSPR波段有很大的蓝移，在添加ALP后可以观察到明显的AuNS溶液的颜色和温度变化，无需先进的设备就可以方便地读出。无需任何信号放大，可检测到低至0.5 pM的碱性磷酸酶。该方法随后扩展到ALP-linked免疫吸附检测癌症生物标志物检测，通过观察颜色和温度直接读出诊断结果。成功定量检测了复杂样品中的PSA，检出限为0.95 ng/mL。纳米传感器在实际临床样本中也表现出了令人满意的监测PSA变化的性能。这种通过酶触发晶体生长的等离子体和光热检测为酶分析和免疫分析提供了一种敏感的方法，使颜色和温度的双重读出成为可能，非常简单和准确。

研究内容

AuNPs和AuNS的表征

  制备了聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米金粒子(PVP-AuNPs)作为金纳米星生长的种子(AuNS)。透射电子显微镜(TEM)图像显示，PVP修改后AuNPs的大小基本保持不变。然而，AuNPs的紫外光谱从524 nm变道530 nm。通过动态光散射得到流体力学尺寸(DLS)从24.2 nm增大到33.1 nm。用TEM和DLS对制备的纳米粒子的形貌和尺寸进行了表征。AuNS由一个中心核组成，多个尖端突出，大小分布为83.6±4.9 nm。DLS分析表明，AuNS的水动力直径为负zeta电位为−20.2mV。结果表明，纳米粒子具有较宽的等离子体激发带，在波长处有两个吸光度峰560和770 nm，它们分别被归因于位于核和尖端的等离子体性质。

等离子体的原理和可行性,光热光谱分析免疫测定

  免疫分析的原理如scheme1所示，当目标抗原存在时，抗原、捕获抗体(Ab1)和生物素识别抗体(Ab2)将形成夹在中间的免疫复合物。链霉亲和素碱性磷酸酶(streptavidin-ALP)可以通过生物素−亲和素相互作用与Ab2结合，并作为酶联免疫吸附试验(ELISA)的标记酶。ALP催化抗坏血酸磷酸盐(AAP)脱磷生成抗坏血酸(AA)后，吸附在AuNS表面的Ag+被还原为Ag⁰。ALP引发的银沉积在AuNS上，导致了Au/Ag NS晶体的生长和镀银AuNS的形成。众所周知，金属纳米结构的等离子体波长对周围介质的介电特性非常敏感。由于银和金的介电常数杂化，银的涂层可能导致等离子体共振峰的蓝移和AuNS溶液的颜色变化。此外，通过等离子体激元的变化，可以通过壳层控制贵金属纳米结构的光热转换。当等离子体共振从光照波长偏移，光吸收发生变化时，AuNS的光热转换效率和周围环境温度也会发生相应的变化。因此，ALP在AuNS上触发晶体生长，纳米传感器可以通过颜色和温度双重读出免疫分析。

Scheme1等离子体和光热免疫分析基于酶引发的晶体生长。

在此基础上，探讨了等离子体光热分析方法的可行性。首先，对不同组分的潜在反应物进行孵育，研究晶体生长对AuNS的LSPR、颜色和光热转导效率的影响。所示1A,B，既无颜色也无局部表面等离子体在无链霉亲和素ALP、AAP或Ag+的情况下，AuNS的LSPR峰发生改变。只有在AA存在或同时存在ALP和AAP时，LSPR才出现超过200 nm的蓝移，颜色由蓝色变为橙色。

图1所示。ALP激发Ag晶体在AuNS上生长。(A)在无试剂和有试剂的情况下AuNS样品的紫外-可见光谱。(B)AuNS溶液在不同试剂存在下的照片。(C)原始AuNS的TEM图像。(D)透射电镜图像晶体生长后的AuNS。(E)代表性AuNS样品与纯水的温度曲线。

    这些结果表明，是ALP催化AA的生成导致了银在AuNS上的沉积。

通过TEM对比纳米粒子的形貌和尺寸，证实了纳米粒子表面银的成功沉积

AuNS和Au/Ag NS。如图1C、D所示，AuNS的尖锐突起消失了，生长后纳米粒子的尺寸从83.6 nm增大到88.4 nm。

 同样，我们研究了不同组分作用下AuNS的光热转换效率(图1E)。没有AuNS的溶液温度变化很小，说明在光照下没有光热加热。未镀银的AuNS均在30左右温度随辐照时间的延长而增加，然后达到平衡。可以看出，由于LSPR峰值与照明激光波长808 nm相似，这些系统表现出相似的明显的温度变化。相反，在808 nm波长下，LSPR发生蓝移的镀银AuNS在接近本底温度的范围内变化很小。这是由于等离子体共振从770 nm偏移到540 nm，而540 nm距离激光照明波长较远。因此，光吸收降低，光热转换效率的Au/AgNS抑制作用明显，且温度无明显升高。

等离子体光热法测定碱性磷酸酶

   对于敏感的等离子体和光热ELISA，我们首先进行了研究在AAP和银离子存在的情况下，ALP在AuNS上触发晶体生长。研究了AuNS的等离子体和光热特性对ALP活性的响应。优化了几个实验参数，以获得良好的ALP活性和ALP-linked免疫测定反应。在37°C的Tris-HCl溶液(0.1 M, pH 9.5)中，ALP引导的晶体生长在AuNS上。另外还研究了Ag+浓度、AAP浓度、酶促反应的孵育时间等因素。随着Ag+浓度的增加，AuNS的LSPR峰移(Δλ)逐渐增加0 ~1.5 mM， Δλ在0.7 mM浓度时达到平台，推测较高浓度的Ag+可以加速Ag+的还原反应，也可以获得更多的银沉积。此外，随着AAP浓度的增加，Δλ也增加，在0.5 mM AAP时达到最大偏移。酶解时间对酶解反应也有影响。在最佳Ag+和AAP浓度下，Δλ随着反应时间的延长，AuNS逐渐增加，30min后接近恒定值，说明孵育时间适合探测目标。此外，随着ALP浓度的增加，磷灰石和磷灰石的含量增加，LSPR峰偏移幅度较大，表明ALP浓度越高，银沉积越多。因此，在后续研究中，采用含有0.7 mM Ag+和0.5 mM AAP的检测液与ALP和AuNS孵育30 min。

  在最佳实验条件下，记录了体系在不同浓度ALP作用下的吸收光谱。随着ALP浓度从0 nM增加到2 nM, AuNS的LSPR峰逐渐蓝移约220 nM(图2A)。这与ALP对AAP的逐渐水解和AuNS表面银的沉积相一致。图2B显示了LSPR峰移对ALP浓度的依赖性。在0 ~ 1 nM范围内，随着ALP浓度的增加，AuNS的Δλ值不断增加，然后在1~2nM范围内趋于稳定。相应的线性回归方程为Δλ = 240.24c−0.71 (r2= 0.998)，其中Δλ为LSPR蓝移，c为ALP浓度。该等离子体纳米传感器无需任何放大方法，可以定量检测碱性磷酸酶，检出限低比之前报道的方法要好。如图2B插图所示，随着ALP浓度的增加，溶液颜色由蓝色变为紫色，最后变为橙色，实现了方便直接的肉眼检测ALP。展示照片,热效应高山纳米传感器的检测系统与不同的高山浓度与波长808 nm的激光辐照5分钟。随着照射时间的增加,溶液的温度逐渐增加,达到一个恒定值后5分钟(图2C)。图2D显示AuNS溶液的光热效应与ALP浓度有关。ALP浓度在0 ~ 50 pM范围内显著抑制AuNS的升温，在50 pM ~ 2 nM范围内达到恒定值。在0.5 ~ 20 pM范围内，温度升高与ALP浓度呈线性关系。不需要结合扩增技术，用一种检测方法即可实现对ALP的高灵敏度检测极限为0.5 pM，这是近20倍的增强比等离子体检测。此外，温度增量几乎不受环境温度的影响，表明了温度信号的可靠性和鲁棒性。从这些结果可以看出，该纳米传感器将比色和温度双信号结合在一起，不仅可以通过肉眼观察颜色进行初步筛选，而且可以通过温度信号进行准确诊断，灵敏度显著提高。

图2等离子体光热法测定碱性磷酸酶。(A) AuNS溶液在不同浓度下的吸收光谱ALP从右至左依次为0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 nM。(B) LSPR吸收带蓝移(Δλ)随ALP浓度的变化，如(a)所示。插图:AuNS样品在不同浓度ALP: 0、0.01、0.05、0.1和1 nM时的对应照片。(C)不同浓度下AuNS样品的温度曲线0, 0.0005, 0.001, 0.005,0.01, 0.02, 0.05, 0.1，在808 nm辐照下，从上到下分别为1、2 nM。(D)温度升高(ΔT)作为ALP浓度的函数。插图:温升之间的线性关系(ΔT) AuNS和ALP的浓度。

双读出免疫分析的颜色和温度。

  利用等离子体和光热纳米传感器对ALP的敏感检测允许通过ALP触发在AuNS上晶体生长的免疫分析的发展。本文将前列腺特异性抗原(PSA)作为等离子体和光热ELISA的模型分析物。随着捕获抗体、生物素识别抗体和链霉亲和素- ALP浓度的增加，酶解反应加快，AuNS 的LSPR峰移较大。

因此，采用含有20 μg/mL捕获抗体、1 μg/mL生物素识别抗体和0.5 μg/mL链霉亲和素ALP的检测液进行后续免疫分析。在优化的条件下，采用免疫双读出法检测不同浓度的PSA。如图3A所示，随着PSA浓度的增加AuNS的LSPR峰值从771逐渐蓝移至550 nm。溶液颜色由蓝色变为橙红色(图3,插图)。图3B显示了Δλ对PSA浓度的依赖性。随着PSA浓度从0增加到350 ng/mL， Δλ逐渐增加，然后在某一浓度范围内趋于稳定350 ng/mL至1 μg/mL。ΔλAuNS随PSA浓度的增加而线性增加10 ~ 200ng /mL (Δλ =0.95c−7.75,R2 = 0.990)。PSA检出限为1.53 ng/mL，低于前列腺癌临床检测的截断点4.0 ng/mL。光热ELISA检测PSA。光-热转换谱与纳米粒子的吸收光谱有关，aun的等离子体共振谱与纳米粒子的大小和形态密切相关，尤其是穗状粒子的长度和数目因此，psa依赖的alp通过银沉积在aun上引发晶体生长导致蓝移LSPR和低的光热转换效率，从而抑制了溶液的温度升高。如图3C所示，随着激光辐照时间从0 s增加到300 s, AuNS溶液的温度逐渐升高。随着PSA浓度的增加，AuNS溶液在808 nm辐照下表现出较低的光热对话效率，即Au/Ag的LSPR带距离辐照波长偏移较大，808 nm处吸光度下降较大。随着PSA浓度从0 ng/mL增加到500 ng/mL，温度升高的效果较差(图3D)这些结果与银的逐渐沉积在AuNS和LSPR峰蓝移相一致。光热ELISA可以根据温度读出免疫分析结果。ΔT和PSA浓度之间的定量关系在0 ~ 150 ng/mL范围内，检测浓度为1 ng/mL。总体而言，免疫分析的比色读数除肉眼外，温度变化可通过灵敏度高的温度计轻松读出，适用于资源有限、设备昂贵的地区PSA的即时检测。此外，目前的等离子体光热纳米传感器用于PSA检测的灵敏度是相当的，甚至高于其他一些分析方法。因此，这种等离子体和光热纳米传感器使多功能和敏感的免疫分析，并允许双读数，简单和高可靠性。

图3双读出免疫分析的颜色和温度。(A)不同浓度PSA(0、5、10、20、50、100、150、200、350 ng/mL)对AuNS溶液的吸收光谱(从右到左)0.7 mM Ag+和0.5 mM AAP存在。(B) LSPR吸收带蓝移(Δλ)随PSA浓度。插页:微孔上不同浓度PSA下AuNS样品的照片。(C)在PSA浓度为0、5、20、50、70、100、150、200和500 ng/mL时，AuNS分散体的温度曲线分别为0、5、20、50、70、150、200和500 ng/mL在808 nm激光照射下，从上到下均为g/mL。(D)温度升高(ΔT)与PSA浓度的关系。

  此外，我们利用牛血清白蛋白(BSA)、α-胎蛋白(AFP)、谷胱甘肽(GSH)、癌胚抗原(CEA)和凝血酶(ThB)等其他常见生物物种，评估了免疫分析对PSA检测的选择性。如图4所示，PSA 的存在标准分析溶液导致200 nm的蓝移LSPR峰值和颜色变化明显，但其他常见生物物种的引入导致的LSPR偏移和颜色变化微不足道。

图4传感器对PSA检测的选择性。PSA的分析物浓度为0.5 μg/mL，其他靶标的分析物浓度为1 μg/mL。Δλ对应于不同分析物存在时AuNS LSPR吸收带的蓝移。插图:加入不同分析物后的aun样品在微孔上的照片。

进一步将免疫传感器应用于检测复杂样品中的PSA。如图5A所示，随着PSA浓度的增加，LSPR峰逐渐蓝移，Δλ在浓度达到一个平台200ng /mL(图5B)在20 ~ 150 ng/mL浓度范围内，Δλ与PSA升高呈线性关系，该方法对PSA的检出限可达0.95 ng/mL(图S8A)。随着激光照射，溶液温度随时间逐渐升高，ΔT随着PSA浓度从0到500 ng/mL逐渐降低(图5C, D)。相应的线性回归方程为ΔT =−0.34c + 29.00 (R2 = 0.999)，其中ΔT为温度c为PSA浓度。即使在1.0ng/mL浓度下，其温度也明显下降1°C。

  结果表明，等离子体光热免疫分析法适用于复杂生物样品的检测。此外，我们通过分析8例患者的血清，将该方法应用于实际临床样本的PSA检测。PSA阳性样本采集于PSA水平高于截断值的临床患者，而PSA阴性样本则低于截断值。阳性样品呈现颜色变化和吸光度变化，而阴性对照则没有任何变化(图6A和S9)。这种差异使PSA的初步筛选复杂的生物样品通过肉眼观察。

图5血清PSA的等离子体光热免疫分析。(A) 0.7 mM Ag+和0.5 mM AAP存在时AuNS溶液在不同浓度下的吸收光谱PSA。(B) LSPR吸收带蓝移(Δλ)随PSA浓度的变化。(C) 808 nm辐照下血清中不同PSA浓度的AuNS分散体的温度曲线。(D)温度升高(ΔT)与PSA浓度的关系。PSA浓度:0、1、5、10、20、50、70、100、150、200、350和500 ng/mL。

  图6结果表明，阳性样品的温度明显低于阴性样品的温度。结果表明，光热法比比色法具有更高的灵敏度。可见，双读数法结合了两种分析方法的优点，结果更加可靠、准确，特别是对于复杂样品的检测。结果表明，该方法具有较高的诊断准确率，可用于临床诊断。

图6通过颜色(A)和温度(B)读出真实临床样本中的PSA免疫分析。P1−P3表示临床上诊断为阳性的不同前列腺癌患者，而N1−N5表示临床诊断为阴性的非前列腺癌患者。

总结

综上所述，我们提出了一种基于AuNS晶体生长的等离子体光热免疫分析方法。该纳米传感器可以检测碱性磷酸酶，检测限低，并可以方便地通过颜色和温度读出分析结果。该方法无需先进的仪器，对双读出免疫分析具有显著的灵敏度和选择性。该免疫传感器可用于临床实际标本的PSA检测。据设想，这项工作可能会激发使用具有良好光热效率的不同等离子体纳米颗粒或功能材料进行生物分析和免疫分析，并促进即时诊断的发展。

参考文献

LiuY, Pan M, Wang W, et al. Plasmonic and photothermal immunoassay via enzyme-triggeredcrystal growth on gold nanostars[J]. Analytical chemistry, 2018, 91(3):2086-2092.